OBJETIVOS
-Analizar los conceptos de cromatografía de líquidos para explicar la separación de diversos compuestos de interés en el ámbito científico e industrial.
-Familializarse con el manejo correcto del cromatógrafo de líquidos, identificando físicamente las partes de que consta.
-Identificar cualitativamente y cuantitativamente por el método de estándar externo los parabenos contenidos en diferentes muestras, utilizando las técnicas de cromatografía de líquidos de alta resolución.
INTRODUCCIÓN
La cromatografía de líquidos es un método de separación física basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre una fase estacionaria y una fase móvil que en este caso es un líquido (Skoog, et. al., 2001, pp. 721). Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de micrones lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que la fase móvil fluya a velocidades razonables (Day, et. al., 1989, pp. 453).
Cromatografía de absorción: La fase estacionaria es un sólido y se utiliza casi exclusivamente sílice o alúmina.
Cromatografía de reparto o partición: Fase estacionaria son compuestos ligados químicamente a un soporte de sílice.
Cromatografía de iones: Columnas rellenas con fases estacionarias con una determinada carga que retienen los iones con carga opuesta.
Cromatografía de exclusión por tamaño: La fase estacionaria está formada por partículas de porosidad definida y uniforme.
ACTIVIDADES PREVIAS
1. Diga qué detectores se emplean en la cromatografía de líquidos y describa el funcionamiento de dos de ellos
Detectores de absorbancia: Son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los haces se utilizan detectores fotoeléctricos contrastados.
Detectores de índice de refracción: Miden la diferencia de índice de refracción entre el disolvente en su camino hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el efluente de al columna pasa por la otra cubeta.
Detectores de absorbancia UV con filtro
Detectores de absorbancia UV con monocromadores
Detectores de absorbancia en el IR
Detectores de fluorescencia
Detector de dispersión de luz
Detectores electroquímicos
2. Diga que tipos de columnas se pueden emplear en el análisis por cromatografía de líquidos, describa algunas
-Columnas analíticas: Por lo común las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas.
-Precolumnas: Elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes.
3. Indique qué compuestos diferentes a los parabenos se pueden analizar por cromatografía de líquidos y que se utilicen en la industria farmacéutica
Separación de iones alcalinos en una columna de intercambio catiónico. Eluyente: Diclorhidrato de fenilendiamina 0.025M/HCl 0.0025M.
Separación de aminoácidos con una columna de intercambio iónico. Relleno: intercambiador catiónico con un tamaño de partícula de 8 µm.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
1. Definir los siguientes términos:
· tiempo de retención: es el tiempo que retiene la columna un compuesto, puede haber o no interacciones con la columna.
· fase estacionaria: se encuentra en el empaque de la columna y puede ser fabricado con muchos compuestos por los cuales se realiza la separación de compuestos, se escoge la fase estacionaria a utilizar de acuerdo a la naturaleza química de los compuestos a separar.
· fase móvil: es el disolvente, transporta las moléculas de la muestra a través de la columna de acuerdo a su polaridad sin interaccionar con esta.
· plato teórico: es el volumen requerido por una molécula para establecer un equilibrio entre ella, la fase estacionaria y la fase móvil. Mientras más platos teóricos tenga una columna, mejor será su resolución
· factor de capacidad: es una medida del tiempo de retención en unidades de tiempo (tm). En otras palabras, es el tiempo que requiere la fase móvil o un soluto no retenido para atravesar la columna.
· factor de selectividad: es un término que define que tan selectiva es una columna para separar dos picos (sustancias). La columna puede ser selectiva a una separación, que se identifica por un valor alto de este factor, pero si no se considera la mejora de los parámetros que pueden afectar el ancho de un pico, aun así no se lograría la separación de los mismos.
· Resolución: la resolución de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analítos, se toma en cuenta el ensanchamiento de los picos para su determinación.
· fase normal: (NP-HPLC) separa los compuestos en base a su polaridad. Utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria, la fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto.
· fase reversa: (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria no polar y una fase móvil de polaridad moderada. El tiempo de retención es mayor para las moléculas no polares, mientras que las moléculas de carácter polar salen más rápidamente.
2. Calcular los parámetros cromotográficos para la muestra analizada:
· Tiempo de retención:
Tiempo de retención (Tr) = 2.243 min.
Tiempo muerto (Tm) = 0.91 min.
· Tiempo de retencion ajustado:
· Numero de platos teoricos de la columna:
Donde:
W= ancho el pico en min. o cm.
Tr= tiempo de retención = 1.333 min.
No la podemos calcular por no tener la grafica, nos hace falta el ancho del pico.
· Resolución de la columna:
Tr a = tiempo de retención de la sustancia A
Tr b= teimpo de retención de la sustancia B
Wa= ancho del pico de la sustancia A
Wb= ancho del pico de la sustancia B
· Eficiencia:
3. Obtener la grafica ajustada de Área vs concentración para cada uno de los parabenos. Presentar el valor de r2
· Curva de concentraciones vs área bajo la curva
4. Utilizar la ec. obtenida para calcular la concentración de las muestras problema en mg/ml y en ppm.
· La ecuación que linealiza la curva de concentración de metilparabeno es:
· La ecuación que linealiza la curva de concentración de propilparabeno es:
Donde:
X= concentración en mg/ml
Y= área bajo la curva
· La siguiente tabla muestra los resultados de las muestras problemas para los diferentes equipos:
| Muestra | Tr | Área bajo la curva | Concentración en mg/ml | Concentración mg/L (ppm) | |
| Muestra problema | Metilparabeno | 1.333 | 435.408 | 0.007995 | 7.995 |
| Propilparabeno | 2.016 | 350.523 | 0.012363 | 12.363 | |
| Muestra 5 | Metilparabeno | 1.35 | 154.822 | 0.003661 | 3.661 |
| Propilparabeno | 2.016 | 5867.273 | 0.156501 | 156.501 | |
| Muestra 8 | Metilparabeno | 1.333 | 237.175 | 0.004932 | 4.932 |
| Propilparabeno | 2.4 | 152.499 | 0.007189 | 7.189 | |
| Muestra 10 | Metilparabeno | 1.333 | 201.313 | 0.004378 | 4.378 |
| Propilparabeno | 2.4 | 96.653 | 0.00573 | 5.73 | |
1. Mencionar los cuidados que se deben de tener al preparar la muestra antes de inyectar en el cromatografo.
· Deben ser sustancias con un grado de pureza HPLC.
· Deben de filtrarse con filtros de diámetros de poro de alrededor de 20 μm y 45μm.
· Se tienen que lavar los tubos que contendrán la muestra con agua desionizada grado HPLC.
2. Mencionar los cuidados que se deben tener con el disolvente utilizado.
Hay que tener mucho cuidado en manejar el metanol HPLC utilizado, es peligroso en caso de inhalación, contacto con los ojos, contacto con la piel, en caso de ingesta, es carcinógeno, toxico para el sistema nervioso y reproductivo; además de tener cuidado de no contaminar su contenedor por su costo tan elevado.
3. Mencionar algunas aplicaciones de HPLC en su carrera.
· Caracterización de aceites esenciales: se basa en la detección de sustancias terpenicas responsables de propiedades aromáticas en los alimentos.
· Análisis de nitrosaminas en agua potable: las nitrosaminas son sustancias carcinógenas potenciales, se debe controlar su presencia en agua potable. Para esto se usa extracción de la fase sólida y GC con columna capilar
· Se puede usar para la determinación de alcohol en sangre.
· Detección de pesticidas en aves y peces.
· Detección de contaminación por dioxinas las cuales son muy perjudiciales para la salud humana, al usar detectores de conductividad electrolítica.
· Control de calidad en la fabricación de fármacos.
4. Investigar que son los parabenos y en que procesos industriales se utilizan.
Son un grupo de productos químicos utilizados como conservantes en la industria cosmética y farmacéutica y como aditivos en la industria alimentaria, tienen propiedades bactericidas y fungicidas, pueden ser encontrados en champús, cremas hidratantes, geles para el afeitado, lubricantes sexuales, medicamentos tópicos y parenterales, autobronceadores y dentífricos.
5. ¿Cuál es el objetivo de purgar la fase móvil?
Se purga para homogeneizar la columna y que no haya residuos de alguna fase móvil de un experimento realizado anteriormente, con eso aseguramos que los compuestos que separamos son única y exclusivamente los que nosotros adicionamos a la maquina.
CONCLUSIONES
· El valor de r2 para el metilparabeno y propilparabeno representan el margen de error que tiene nuestro método matemático para calcular alguna concentración a partir del área bajo la curva o viceversa.
· La columna tiene una polaridad más parecida a la del propilparabeno, por eso es que el metilparabeno sale antes; al adicionarle la muestra problema, la columna retiene momentáneamente al propilparabeno por polaridad y permite el paso del metilparabeno con el disolvente, esto también indica que el metilparabeno tiene una polaridad similar a la del metanol, o por lo menos una polaridad mas similar que la del propilparabeno con el metanol.
· Si se cambiara la relación de la fase móvil metanol de 60-40 a cualquier otra proporción, el tiempo de salida del metilparabeno y propilparabeno cambiarian; si por ejemplo usaramos una relación 40-60 el metanol arrastraría en poca cantidad al metilparabeno y por lo tanto al propilparabeno, aumentando el tiempo de retención. El pico tendría el mismo ancho, solo que mas desplazado en la grafica.
· Se logro la separación e identificación de metilparabeno y propilparabeno en la muestra problema, determinando mediante la curva tipo de concentraciones la cantidad de cada sustancia en mg/ml y ppm.
BIBLIOGRAFÍA
-Chang, R. (2008). Fisicoquímica (3ª ed.). E. U. A.: McGraw-Hill
-Chang, R. (2010). Química (10ª ed.). E. U. A.: McGraw-Hill
-Day, R. y Underwood, A. (1989). Química analítica cuantitativa (5ª ed.). México, D.F.: Prentice-Hall Hispanoamericana
-Skoog, D., West, D., Holler, F. y Crunch, S. (2001). Química analítica (7a ed.). México, D. F.: McGraw-Hill
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La creencia en el valor de la verdad científica no procede de la naturaleza, sino que es producto de
determinadas culturas.
- Weber
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