domingo, 29 de marzo de 2015

Liofilización y rehidratación de Escherichia coli

INTRODUCCIÓN


Los microorganismos representan un papel esencial para el mantenimiento y funcionamiento de los ecosistemas globales y como fuente de nuevos recursos para el desarrollo de diversas disciplinas. Pueden resultar benéficos para ser utilizadas con fines biotecnológicos (Broadbent et al., 2003; Chemier et al., 2009), agrícolas (Bloemberg & Lugtemberg, 2001), biomédicos (Morales-García et al., 2007), ecológicos (Straight & Kolter, 2009) y de biorremediación (Paul et al., 2005; Ramos et al., 2005). Por ejemplo, algunas bacterias promueven el crecimiento de las plantas a través de diferentes mecanismos, entre los que se incluyen la Fijación Biológica de
Nitrógeno (FBN), el aumento de disponibilidad de nutrientes en la rizósfera, etc.

En la última década, se ha visto un marcado aumento en la concientización del valor de las colecciones de cultivos. El acelerado desarrollo de la industria farmacéutica y biotecnológica, así como el potencial uso de los microorganismos, obligan cada vez más a promover actividades de aseguramiento de la calidad para su conservación, de manera que puedan ser utilizados en diversos ensayos analíticos en los laboratorios de control microbiológico.

La necesidad de mantener y disponer de cultivos de calidad impulsó la introducción de métodos de conservación de microorganismos que reducen al mínimo la posibilidad de contaminación y garantizan al menos la supervivencia del 70 % de las células por un periodo determinado de tiempo. La liofilización es el método de elección debido a sus numerosas ventajas, entre las que se puede resaltar la posibilidad de minimizar al máximo el riesgo de cambio genético en las células y las mantienen viables por 10 años o más. Además es recomendable por su comodidad en almacenamiento y transporte de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden almacenarse a una temperatura ambiente de 18 a 20 ºC o bien de 4 a 6 ºC. (Figura 1)


Figura 1: Bacteria viva atenuada liofilizada (cepa Clemson) para prevenir el Cólera Aviar de las aves.

El laboratorio de control microbiológico de Laboratorios Liorad disponía de una colección de cepas procedentes de subcultivos de cepas de referencia de la American Type Culture Collection (ATCC). El método de conservación empleado era la congelación a – 70 0C, metodología que no resulta la más conveniente para la conservación por largos periodos de tiempo, De hecho, algunas veces se fracasa en preservar a un microorganismo por congelación y sin crioprotectores podrían formarse agujas de agua y también se genera un estrés osmótico debido a la baja disponibilidad de agua que ocurre durante el proceso de congelación (Perry, 1995).

Por tal motivo surgió la necesidad de evaluar otra estrategia de conservación para estos microorganismos. La metodología propuesta fue emplear el Caldo Triptona Soya (CTS) como medio de crecimiento, la leche descremada y el glicerol al 20% (sustancias lioprotectoras), la liofilización como método de conservación y ensayos de calidad: viabilidad, pureza e identidad. La selección de los aditivos que permitan lograr tanto una buena apariencia como una estabilidad prolongada del material liofilizado es uno de los aspectos más importantes a tener en cuenta al emplear este método


Cepa a liofilizar: Escherichia coli

Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram (gramnegativo), es anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++--.

Figura 2. E. coli vista al microscopio.

OBJETIVOS

General

·      Evaluar los resultados de la conservación de la cepa microbiana Escherichia coli por el método de liofilización.

Específicos

·         Liofilizar correctamente un pequeño volumen de E. coli
·         Rehidratar la muestra liofilizada y cultivarla en placa
·         Determinar si el proceso de liofilización afectó la viabilidad de las células.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


Preparación del medio de cultivo y cajas de cultivo.
Se prepararon 30 mL de medio LB para los 7 equipos del laboratorio, y cada uno preparó 2 cajas Petri. El material y el medio se esterilizaron a 121°C y 15 PSIA de presión durante 15 minutos. Se vertieron aproximadamente 10 mL de medio de cultivo en cada placa y se guardaron durante 7 días.

Liofilización de las células
A partir de un cultivo líquido de E.coli facilitado por la profesora, se tomaron alícuotas de 3 mL y fueron depositadas en pequeños viales de vidrio. Los viales se taparon con tapón de algodón y gasa y fueron congelados en hielo seco y acetona. Posteriormente se insertaron en la liofilizadora y se corrió el ciclo normal, durante 2 horas 40 minutos.

Rehidratación de la muestra
Una vez liofilizadas las células, dentro de la campana de flujo laminar, se adicionaron 3 mL de agua destilada y se agitó durante un minuto.
 
Cultivo e incubación de las muestras
En condiciones de esterilidad, se realizó vaciado en placa de 1 mL de la muestra rehidratada, en cada caja Petri. Con ayuda de una pequeña asa, se esparció el líquido a lo largo del agar. (Figura 3) Después de mantuvieron las cajas a temperatura ambiente (25-27°C) durante 7días.

Figura 3: Procedimiento para sembrar la bacteria rehidratada en agar LB.

RESULTADOS

Figura 4: Muestra en los viales (de izquierda a derecha): Antes de liofilizar, durante liofilización y después de la liofilización.


Tabla 1: Relación de los pesos registrados y el peso perdido después de liofilizar la muestra
Volumen de alícuota
Peso inicial en el vial
Peso en el vial después de liofilizar
Porcentaje de peso perdido
3 mL (3.0269 g)
17.6980 g
16.2566 g
47.57%  (1.44 g)

Figura 5: Cajas Petri después de haber sido incubadas a temperatura ambiente por 7 días. Es notable el crecimiento de colonias de E. coli. Algunas cajas se contaminaron con hongos también, pero es evidente la diferencia de las colonias fúngicas a las bacterianas. 

DISCUSIÓN


La liofilización que realizamos en el laboratorio no se llevó hasta su término debido a cuestiones de falta de tiempo. En la Figura 4 se observa cómo el vial aún presentaba una cierta cantidad de hielo (agua que no sublimo) y otra parte ya líquida, lo que indica que efectivamente restaba un porcentaje de humedad notable;

La mayor parte de esa humedad no se retiró, aunque sólo era visible muy poco líquido cuando se retiró el vial de la liofilizadora. El porcentaje de masa retirada fue 47.57% (Tabla 1), lo que afirma que quedó una cantidad considerable de agua en la muestra.

La rehidratación se realizó sin problemas, y cuando se observó el crecimiento bacteriano transcurrida una semana, fue obvio que la cepa sobrevivió el proceso de liofilización al que fue sometida. No sólo hubo crecimiento homogénea, sino que también las colonias fueron numerosas y grandes (Figura 5).

Con esto determinamos que el proceso de conservación fue exitoso. El protocolo coincie con recomendaciones que varios autores hacen para la correcta conservación (García & Uruburu, 2000): se evitaron posibles contaminaciones durante el proceso y durante el tiempo en que la cepa permanezca liofilizada, conviene que sobreviva en números elevados.

No obstante, en la liofilización celular se recomienda tener un cuidado en el momento de la congelación que nosotros no seguimos. Se reporta que las células del cultivo se lavan o no con una  solución tampón y después son adicionadas con un volumen equivalente de una suspensión que contiene una sustancia que deberá funcionar como protectora de las células a la congelación (Perry, 1995). Esa  sustancia es conocida con el nombre de “crioprotector”,  no existe uno universa; sin embargo gracias a la experiencia de diversos laboratorios, se ha generado un gran conocimiento acerca de la forma efectiva para preservar un microorganismo y del tipo de crioprotector que se debe usar  (Hubálek, 2003) (Tabla 2).

Tabla 2: Crioprotectores usados para preservar bacterias. (Perry, 1995)

Se reporta que los disacáridos protegen a las células al sustituir a las moléculas de agua, durante el proceso de  liofilización (Leslie et al., 1995; Crowe et al., 2003). De esta forma las células no pasan de  su estado de cristal líquido a la fase de gel y mantienen su estructura celular intacta  (Leslie et al., 1995), lo cual posibilita a que la  membrana no sufra rupturas durante el proceso de liofilización y/o rehidratación.

Los factores que influyen en la supervivencia de los microorganismos a la liofilización son muy complejos y poco entendidos. (Stell, 2008). En esta práctica no se realizó un análisis de la viabilidad antes y después de la liofilización, sin embargo eso hubiera sido muy adecuado para determinar la tasa de supervivencia de la cepa de E. coli utilizada en este procedimiento. De igual manera, realizar un ensayo de liofilización utilizando un criprotector habría permitido comparar los datos de supervivencia reportados en la bibliografía (Tabla 3) con nuestro experimento, y arrojaría no sólo un análisis cualitativo sino también cuantitativo.




Tabla 3: Bacterias preservadas por liofilización y su tasa de supervivencia.(Stell, 2008)

CONCLUSIONES


·         No se logró liofilizar completamente una muestra de E. coli viable.
·         Se Rehidrató la muestra liofilizada y tras cultivarla en placa e incubarla por siete días, se observó que aún era viable.
·         Utilizar un agente crioprotector habría reducido el daño por congelación previo a la liofilización.

 



BIBLIOGRAFÍA

·         Morales-García (2010) “Bacterias Preservadas, una Fuente Importante de Recursos Biotecnológicos “BioTecnología, Vol. 14 No. 2
·          Burguet Lago et Al. (2012)“Conservación de cepas microbianas por el método de liofilización para el control microbiológico en Laboratorios Liorad” Revista CENIC, Vol. 43, No. 3
·         . Morales YE, Duque E, Rodríguez O.(2010) “ Bacterias preservadas, una fuente importante de recursos biotecnológicos”. Rev. Biotecnología Aplicada.
·         Stell KJ, Ross HE. Survival of freeze dried bacterial cultures. J. Appl. Microbiol. 2008.
·         Perry SF. Freeze-drying and cryopreservation of bacteria. Methods Molecular Biotechnology. 1995.


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