INTRODUCCIÓN
Los microorganismos representan un
papel esencial para el mantenimiento y funcionamiento de los ecosistemas
globales y como fuente de nuevos recursos para el desarrollo de diversas
disciplinas. Pueden resultar benéficos para ser
utilizadas con fines biotecnológicos (Broadbent et al., 2003; Chemier et al.,
2009), agrícolas (Bloemberg & Lugtemberg, 2001), biomédicos (Morales-García
et al., 2007), ecológicos (Straight & Kolter, 2009) y de biorremediación
(Paul et al., 2005; Ramos et al., 2005). Por ejemplo, algunas bacterias
promueven el crecimiento de las plantas a través de diferentes mecanismos,
entre los que se incluyen la Fijación Biológica de
Nitrógeno (FBN),
el aumento de disponibilidad de nutrientes en la rizósfera, etc.
En la última década, se ha visto un
marcado aumento en la concientización del valor de las colecciones de cultivos.
El acelerado desarrollo de la industria farmacéutica y biotecnológica, así como
el potencial uso de los microorganismos, obligan cada vez más a promover
actividades de aseguramiento de la calidad para su conservación, de manera que
puedan ser utilizados en diversos ensayos analíticos en los laboratorios de
control microbiológico.
Figura
1: Bacteria
viva atenuada liofilizada (cepa Clemson) para prevenir el Cólera Aviar de las
aves.
El laboratorio de control
microbiológico de Laboratorios Liorad disponía de una colección de cepas
procedentes de subcultivos de cepas de referencia de la American Type Culture
Collection (ATCC). El método de conservación empleado era la congelación a – 70 0C, metodología que no
resulta la más conveniente para la conservación por largos periodos de tiempo, De hecho, algunas veces se fracasa en preservar a un
microorganismo por congelación y sin crioprotectores podrían formarse agujas de
agua y también se genera un estrés osmótico debido a la baja disponibilidad de
agua que ocurre durante el proceso de congelación (Perry, 1995).
Por tal
motivo surgió la necesidad de evaluar otra estrategia de conservación para
estos microorganismos. La metodología propuesta fue emplear el Caldo Triptona
Soya (CTS) como medio de crecimiento, la leche descremada y el glicerol al 20%
(sustancias lioprotectoras), la liofilización como método de conservación y
ensayos de calidad: viabilidad, pureza e identidad. La selección de los aditivos que permitan lograr tanto
una buena apariencia como una estabilidad prolongada del material liofilizado
es uno de los aspectos más importantes a tener en cuenta al emplear este método
Cepa a liofilizar: Escherichia coli
Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y
por ende en las aguas negras, pero se lo
puede encontrar en todos lados, dado que es un organismo ubicuo. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram (gramnegativo), es anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++--.
Figura 2. E. coli vista al microscopio.
OBJETIVOS
General
·
Evaluar los resultados de la
conservación de la cepa microbiana Escherichia coli por el
método de liofilización.
Específicos
·
Liofilizar
correctamente un pequeño volumen de E.
coli
·
Rehidratar
la muestra liofilizada y cultivarla en placa
·
Determinar
si el proceso de liofilización afectó la viabilidad de las células.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Preparación del
medio de cultivo y cajas de cultivo.
Se prepararon 30 mL de medio LB para los 7 equipos del laboratorio, y cada uno preparó 2 cajas Petri. El material y el medio se esterilizaron a 121°C y 15 PSIA de presión durante 15 minutos. Se vertieron aproximadamente 10 mL de medio de cultivo en cada placa y se guardaron durante 7 días.
Se prepararon 30 mL de medio LB para los 7 equipos del laboratorio, y cada uno preparó 2 cajas Petri. El material y el medio se esterilizaron a 121°C y 15 PSIA de presión durante 15 minutos. Se vertieron aproximadamente 10 mL de medio de cultivo en cada placa y se guardaron durante 7 días.
Liofilización de
las células
A partir de un cultivo líquido de E.coli facilitado por la profesora, se tomaron alícuotas de 3 mL y fueron depositadas en pequeños viales de vidrio. Los viales se taparon con tapón de algodón y gasa y fueron congelados en hielo seco y acetona. Posteriormente se insertaron en la liofilizadora y se corrió el ciclo normal, durante 2 horas 40 minutos.
A partir de un cultivo líquido de E.coli facilitado por la profesora, se tomaron alícuotas de 3 mL y fueron depositadas en pequeños viales de vidrio. Los viales se taparon con tapón de algodón y gasa y fueron congelados en hielo seco y acetona. Posteriormente se insertaron en la liofilizadora y se corrió el ciclo normal, durante 2 horas 40 minutos.
Rehidratación de la muestra
Una vez
liofilizadas las células, dentro de la campana de flujo laminar, se adicionaron
3 mL de agua destilada y se agitó durante un minuto.
Cultivo e
incubación de las muestras
En
condiciones de esterilidad, se realizó vaciado en placa de 1 mL de la muestra
rehidratada, en cada caja Petri. Con ayuda de una pequeña asa, se esparció el
líquido a lo largo del agar. (Figura 3) Después de mantuvieron las cajas a
temperatura ambiente (25-27°C) durante 7días.
Figura
3:
Procedimiento para sembrar la bacteria rehidratada en agar LB.
RESULTADOS
Figura
4:
Muestra en los viales (de izquierda a derecha): Antes de liofilizar, durante
liofilización y después de la liofilización.
Tabla 1:
Relación de los pesos registrados y el peso perdido después de liofilizar la
muestra
Volumen
de alícuota
|
Peso
inicial en el vial
|
Peso
en el vial después de liofilizar
|
Porcentaje
de peso perdido
|
3 mL (3.0269 g)
|
17.6980 g
|
16.2566 g
|
47.57% (1.44 g)
|
Figura
5:
Cajas Petri después de haber sido incubadas a temperatura ambiente por 7 días.
Es notable el crecimiento de colonias de E. coli. Algunas cajas se contaminaron
con hongos también, pero es evidente la diferencia de las colonias fúngicas a
las bacterianas.
DISCUSIÓN
La liofilización que realizamos en el laboratorio no se
llevó hasta su término debido a cuestiones de falta de tiempo. En la Figura 4
se observa cómo el vial aún presentaba una cierta cantidad de hielo (agua que
no sublimo) y otra parte ya líquida, lo que indica que efectivamente restaba un
porcentaje de humedad notable;
La mayor parte de esa humedad no se retiró, aunque sólo era
visible muy poco líquido cuando se retiró el vial de la liofilizadora. El
porcentaje de masa retirada fue 47.57% (Tabla 1), lo que afirma que quedó una
cantidad considerable de agua en la muestra.
La rehidratación se realizó sin problemas, y cuando se
observó el crecimiento bacteriano transcurrida una semana, fue obvio que la
cepa sobrevivió el proceso de liofilización al que fue sometida. No sólo hubo
crecimiento homogénea, sino que también las colonias fueron numerosas y grandes
(Figura 5).
Con esto determinamos que el proceso de conservación fue
exitoso. El protocolo coincie con recomendaciones que varios autores hacen para la correcta conservación (García &
Uruburu, 2000): se evitaron posibles contaminaciones durante el proceso y
durante el tiempo en que la cepa permanezca liofilizada, conviene que sobreviva
en números elevados.
No obstante, en la
liofilización celular se recomienda tener un cuidado en el momento de la
congelación que nosotros no seguimos. Se reporta que las células del cultivo se
lavan o no con una solución tampón y
después son adicionadas con un volumen equivalente de una suspensión que
contiene una sustancia que deberá funcionar como protectora de las células a la
congelación (Perry, 1995). Esa sustancia
es conocida con el nombre de “crioprotector”, no existe uno universa; sin embargo gracias a
la experiencia de diversos laboratorios, se ha generado un gran conocimiento
acerca de la forma efectiva para preservar un microorganismo y del tipo de
crioprotector que se debe usar (Hubálek,
2003) (Tabla 2).
Tabla 2: Crioprotectores usados para preservar bacterias. (Perry, 1995)
Se reporta que los disacáridos protegen a las células al sustituir a las
moléculas de agua, durante el proceso de liofilización (Leslie et al., 1995; Crowe et
al., 2003). De esta forma las células no pasan de su estado de cristal líquido a la fase de gel
y mantienen su estructura celular intacta (Leslie et al., 1995), lo cual posibilita a
que la membrana no sufra rupturas
durante el proceso de liofilización y/o rehidratación.
Los factores que influyen en la supervivencia de
los microorganismos a la liofilización son muy complejos y poco entendidos.
(Stell, 2008). En esta práctica no se realizó un análisis de la viabilidad
antes y después de la liofilización, sin embargo eso hubiera sido muy adecuado
para determinar la tasa de supervivencia de la cepa de E. coli utilizada en este procedimiento. De igual manera, realizar
un ensayo de liofilización utilizando un criprotector habría permitido comparar
los datos de supervivencia reportados en la bibliografía (Tabla 3) con nuestro
experimento, y arrojaría no sólo un análisis cualitativo sino también
cuantitativo.
Tabla 3:
Bacterias preservadas por liofilización y su tasa de supervivencia.(Stell,
2008)
CONCLUSIONES
·
No
se logró liofilizar completamente una muestra de E. coli viable.
·
Se
Rehidrató la muestra liofilizada y tras cultivarla en placa e incubarla por
siete días, se observó que aún era viable.
·
Utilizar
un agente crioprotector habría reducido el daño por congelación previo a la
liofilización.
BIBLIOGRAFÍA
·
Morales-García (2010) “Bacterias Preservadas, una
Fuente Importante de Recursos Biotecnológicos “BioTecnología, Vol. 14 No. 2
·
Burguet Lago et
Al. (2012)“Conservación de cepas microbianas por el método de liofilización
para el control microbiológico en Laboratorios Liorad” Revista CENIC, Vol. 43,
No. 3
·
. Morales YE, Duque E, Rodríguez O.(2010) “ Bacterias preservadas,
una fuente importante de recursos biotecnológicos”. Rev. Biotecnología
Aplicada.
·
Stell KJ, Ross HE. Survival of freeze
dried bacterial cultures. J. Appl. Microbiol. 2008.
·
Perry SF. Freeze-drying and
cryopreservation of bacteria. Methods Molecular Biotechnology. 1995.
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