OBJETIVOS

General

· Determinar el efecto del área de la solución congelada en el proceso de secado.

· Observar el efecto de agentes crioprotectores.

Específicos

· Observar el avance del proceso de liofilización a diferentes tiempos.

· Cuantificar el efecto del área sobre el proceso de liofilización.

· Observar la protección del producto por distintos agentes de criopreservación.

INTRODUCCIÓN

En 1993T. A. Jennings define a la liofilización como un procedo de estabilización en el cual el material primero de congela y se concentra el solvente, comúnmente el agua, reduciéndolo mediante sublimación y desorción, a niveles que no sostendrán mas el crecimiento biológico o las reacciones químicas. Consta de tres fases: congelación, desecación primaria y desecación secundaria.

Las etapas de la liofilización involucran varias etapas (Figura 1)

· Congelación (y acondicionamiento en algunos casos) a bajas temperaturas.

· Secado por sublimación del hielo (o del solvente congelado) del producto congelado, generalmente a muy baja presión (Figura 2), generalmente se estudia en dos etapas, a saber: etapa primaria y secundaria de secado.

· Almacenamiento del producto seco en condiciones controladas.

En la liofilización el material original está construido por un núcleo central de material congelado. A medida que el hielo se sublima, el plano de sublimación, que se inicia en la superficie exterior, penetra al interior dejando atrás una corteza porosa de material ya seco. Para el calor latente de sublimación del hielo, equivalente a 2838 kJ/kg, procede por conducción a traces de la corteza del material seco. En algunos casos, también se conduce a través de la capa congelada desde la parte posterior. El vapor de agua que se forma se transfiere a través de la capa de material seco.

Mecanismo de transferencia de calor durante el equilibrio de la congelación .

El flujo de calor (q) puede ser obtenido mediante la ecuación sig.

Etapas del proceso de liofilización

Las tres fases que se distinguen en la Fig.3 son:

Fase1: llamada etapa conductiva, inicialmente, por el calentamiento de la muestra, la velocidad de sublimación crece rápidamente hasta llegar a un máximo. El tiempo para agotar esta fase es relativamente corto; en ella se lleva a cabo la mayor parte de remoción de agua del producto (entre 75-90%), siendo el mecanismo preponderante la transferencia de calor por conducción.

Fase 2: Primera etapa difusiva. Muestra un descenso importante de la velocidad de sublimación debido a la formación de una capa porosa de material seco que opone resistencia creciente al flujo de calor y al vapor a medida que procede el secado.

Fase 3. Segunda esta difusiva. La velocidad de sublimación continua decreciendo de forma que se aproxima a cero. Esto debido a que el calor necesario para retirar el agua ligada es más alto que el calor de sublimación. Pues que la difusividad de los aromas disminuye sensiblemente cuando la humedad es pequeña es posible en esta etapa incrementar la temperatura de la calefacción y del producto hasta valores del orden de 50° C, dependiendo del material que se trate.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES

En matraces kitasato se prepararon 100 mL de solución de glucosa, sacarosa, almidón, gliceraldehído, citrato de sodio, fosfato de sodio y albúmina de huevo, todas al 2% (m/v). Se adicionaron de 5 a 6 trozos de manzana de 1cm x 1cm por solución.

CONGELAMIENTO

En una bandeja con hielo seco y acetona, se congelaron las soluciones hasta su completa solidifcación.

LIOFILIZACIÓN

En el liofilizador se conectaron todos los matraces tapados y se inició el proceso.

PESADO

Se utilizó la balanza digital para determinar las masas a las 0, 1 y 2 horas durante la liofilización.

RESULTADOS

Tabla 1. Diferentes crioprotectores usados por los equipos para la liofilización de manzana.

Equipo	Crioprotector
1	Sacarosa
2	Benzaldehído
3	Citrato de sodio**
4	Fosfato de sodio
5	Albúmina
6	Almidón
7	Glucosa

Figura 4. Apariencia de los trozos de manzana después del proceso de liofilización en diferentes crioprotectores.

Tabla 2. Volúmenes agregados y pesos medidos en el matraz durante el proceso de liofilización en la primera y segunda horas.

Equipo	Crioprotector	Volumen	Peso inicial (g)	Peso 1 hr (g)	Peso 2 hrs (g)
2	Almidón	100 mL	412.9	412.7	410.5
3	Sacarosa	100 mL	333.9	-	331.4
4	Sacarosa	80 mL	290.1	283.8	279.4

DISCUSIÓN

En esta práctica se esperaban tres efectos:

1) La mayor área de congelación sublima más rápido,
2) Disminución del peso inicial, y
2) Protección ante el congelamiento por un agente crioprotector.

El efecto del área de congelación se evaluó agitando en mayor o menor grado los matraces para que congelara de distinta manera. Siguiendo el siguiente esquema:

Debido a problemas con el congelamiento en hielo seco, los matraces de media y menor congelación no pudieron llegar a solidificarse totalmente y la observación del efecto del área no fue exitosa. Los primeros dos matraces tuvieron un decrecimiento muy similar en sus pesos. (Tabla 5)

Se pesaron los matraces antes de iniciar el proceso de liofilización y después de 1 y dos horas. Efectivamente notamos disminuciones de los pesos en todos los casos (Tabla 2). Por la naturaleza del proceso (sublimación del hielo y extracción del vapor de agua), el decremento de la masa al transcurrir el tiempo, es un comportamiento que indica que la operación está efectuándose correctamente.

Tabla 3. Diferencia final de pesos en los matraces. Los resultados no son iguales para los tres ensayos.

Peso inicial (g)	Peso 2 hrs (g)	ΔPeso (g)
412.9	410.5	2.4
333.9	331.4	2.5
290.1	279.4	10.7

En el caso de liofilización. Sin embargo para el tercer ensayo, que usó el mismo crioprotector del segundo, se tuvo un decremento de 10.7 g. Tal disminución no es congruente, pues en ese tiempo no se pierde tanta humedad (fig.4). Se infiere entonces, un posible error en el pesado o lectura de los datos para ese ensayo. Los primeros ensayos (1 y 2), se registró un decremento muy similar aunque se utilizaba diferente crioprotector, observándose un aproximado de 2.5 g menos a las dos horas de iniciado el proceso de

Es importante mencionar que al ya contar con al menos dos puntos (pesos) de la solución que liofilizamos, en diferentes tiempos, es posible determinar la función matemática que describe la pérdida de humedad en el producto (Tabla y Figura 4)

Tabla 4. Variación del contenido de agua en la muestra de manzana y crioprotector de sacarosa para el proceso realizado por el equipo 4. Sólo los tiempos 0, 1 y 2 son resultados experimentales, los demás están basados en la fórmula

Tiempo (h)	% Humedad
0	100
1	92.1249933
2	86.625017
3	82.5664286
4	79.4482535
5	76.9775736
6	74.9716785
7	73.3106908
8	71.9126945
9	70.7198107
10	69.6899839
11	68.7919202
12	68.0018519
13	67.3014037
14	66.6761452
15	66.1145863
16	65.6074643
17	65.1472297
18	64.7276672
19	64.3436134
20	63.9907436
21	63.6654078
22	63.3645044

Figura 5. Variación del contenido de agua para el proceso de liofilización de manzana del equipo 4 usando 80 mL de crioprotector de sacarosa. Gráfica basada en los datos de la tabla anterior. Se deben tomar más datos.

Tabla 5. Variación del contenido de agua según los datos para los tiempos 0, 1 y 2 proporcionados por el equipo 2 cuyo protector fue almidón. Como se puede observar en la tabla y en la gráfica siguiente, los datos a partir de la hora 3 se salen de los rangos esperados.

Tiempo (h)	% agua
0	100
1	99.8
2	97.6
3	100.9
4	100.533333
5	100.428571
6	100.378947
7	100.35
8	100.331034
9	100.317647
10	100.307692
11	100.3
12	100.293878
13	100.288889
14	100.284746
15	100.28125

Figura 6. Gráfica de los datos de la tabla anterior. Como se observa el comportamiento está lejos del esperado y del mostrado en la Figura 4.

La gráfica de la Figura 5 muestra cómo se reduce el contenido de agua dentro del matraz mientras ocurre la liofilización. Hace una asíntota alrededor de 60%, por lo que según esto la eliminación de agua nunca podría hacer que el contenido disminuyera más allá del 60%. Sin embargo, éste no es el resultado esperado y la asíntota debería estar sobre el eje de las abscisas. Para mejorar ésta gráfica se deben tener más de tres datos.

La gráfica de la Figura 6 muestra un comportamiento aún más extraño que la de la Figura 5. En ésta, el contenido de agua, después de disminuir en las horas 1 y 2 sube súbitamente a la hora 3, donde sólo las horas 1 y 2 son resultados experimentales. Éste comportamiento se debe a que la variación del contenido de agua de la hora 0 a 1 es menor a la variación de la hora 1 a 2, 0.2 y 2.4%, respectivamente. Para tener una curva descendente y cóncava hacia abajo como la de la Figura 5, la variación del contenido de agua debe ser mayor de la hora 0 a 1 que de la hora 1 a 2.

El fin de utilizar agentes crioprotectores fue evaluar el daño generado en los trozos de manzana, por el enfriamiento a temperaturas subcero sin protección, (debido al crecimiento interior de cristales de hielo).

Existen tres grupos de agentes crioprotectores:

• Un primer grupo de crioprotectores de bajos pesos moleculares y permeables; entre ellos se encuentra el metanol, el etilenglicol, el propilenglicol, el dimetilsulfóxido, el 2,3 butanediol, el glicerol, y otros alcoholes.

• Un segundo grupo de crioprotectores de bajos pesos moleculares y no permeables, como la galactosa, la glucosa, la sacarosa, la trehalosa y otros azúcares.

• El tercer grupo está constituido por crioprotectores de alto peso molecular y no permeable, entre los que resaltan la polivinilpirrolidona, el alcohol polivinílico, el hialuronidato de sodio, proteínas y otros polímeros.

El grado de protección al producto está directamente vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para la cristalización dañina.

Para la manzana, los mejores agentes de criopreservación son los del segundo grupo (de los cuales usamos sacarosa, glucosa, almidón y gliceraldehído) Aunque cabe resaltar que aquellos con grupos funcionales susceptibles a la oxidación (azúcares reductores) no resultaron buenos protectores, tal fue el caso particular de la glucosa y el gliceraldehído.

El citrato de Sodio y Fosfato de sodio no ofrecieron una buena protección, su efecto fue casi nulo, aunque la Albúmina de huevo (tercer grupo) fue quien menos protección ofreció.

El orden de mayor a menor protección fue: Almidón, sacarosa, gliceraldehído, glucosa, fosfato de sodio, citrato de sodio y albúmina de huevo.

CONCLUSIONES

· El área de congelación es un factor que influye en una liofilización más rápida; sin embargo no fue posible observarlo en la práctica.

· La disminución en el peso de dos muestras liofilizándose es similar siempre y cuando sean soluciones similares y se utilice un mismo liofilizador.

· Se utilizaron 7 crioprotectores distintos y se observó su efecto de preservación.

· La preservación de un crioprotector depende de su afinidad por el producto.

BIBLIOGRAFÍA

· Ávila- Portillo, J., Madero, J. y Bacter, C. Fundamentos de Criopreservación. Revista Colombiana de Obstetricia y Ginecología, 2006, 57(4), 291-300

· Monzo, M., Navarrete, N., Chiralt, A. y Fito, P. Mechanical and Structural Changes in Apple due to vacuum impregnation with cryoprotectants. Journal of Food Science, 1998, 63(3), 499-506

· Navas, R. y Sebastian, J. Liofilizacion de Alimentos, Revista Recitela, 2006, 5(1), pp. 2,9,11-12.