OBJETIVOS
Preparar
medios de cultivo para el cultivo in vitro de tejidos vegetales
Familiarizarnos
con las técnicas de cultivo de vegetales
in vitro y establecer cultivos de callos.
INTRODUCCIÓN
El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de
aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas
condiciones estériles y con unas instalaciones especiales, un ejemplo de un
cultivo in vitro es el establecimiento de callo que es un tejido obtenido por medio del aislamiento
de órganos o tejidos diferenciados, los cuales posteriormente son llevados a
una proliferación continua, acelerada y de apariencia desorganizada que da
origen a una masa amorfa de tejido. Esta masa celular puede presentar
diferentes tipos morfológicos, los cuales varían según la apariencia externa de
la célula.
El callo
esta generalmente constituido por una alta proporción de células en las que las
vacuolas son predominantes, similares a las células del parénquima. Las
respuestas cualitativas y cuantitativas del crecimiento de callo en cultivo
involucran un sinergismo estrecho y complejo entre el origen del tejido usado
para la primera inducción, la composición del medio, es decir el éxito que se
obtenga en un cultivo celular tanto de callos como de otro depende del uso del
medio nutritivo adecuado, como también del empleo de tejidos viables,
incubación, calidad de reactivos. Los ingredientes del medio de cultivo se clasifican en sales inorgánicas (mezclas
de sales), compuestos orgánicos(esto incluye la fuente de carbono, sustancias
hormonales, vitaminas, aminoácidos y amidas), complejos naturales y materiales
inertes de soporte.
La inducción
de callo a partir de una porción vegetal sucede cuando el inoculo ya estéril se
pone en contacto con un medio de cultivo que induzca y mantenga un crecimiento
y una división celular continua (Yeoman y Macleod, 1977).esto incluye la
concentración de los reguladores hormonales presentes en el medio de cultivo,
la característica mas importante del
callo el la totipotencialidad de sus células, ya que, en general, con un manejo
adecuado de las condiciones nutricionales, hormonales y ambientales, tienen la
capacidad de desarrollar brotes, raíces, embriones, etc. los cuales pueden
llegar a formar plántulas completas y la coloración de de el tejido calloso
varia, aun derivando de la misma especie
(se pueden presentar callos que carecen de pigmentación mientras que otros pueden
ser de diferentes tonos de verde, amarillo, café o rojo).El tipo y grado de
pigmentación esta marcadamente influenciado por factores ambientales y
nutricionales, y se manifiesta por la presencia de clorofila, carotenos y
antocianinas(que son pigmentos
hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de las células vegetales y
que otorgan el color rojo, púrpura o azul a las hojas, flores y frutos).
DESARROLLO EXPERIMENTAL
RESULTADOS
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Equipo
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Auxinas
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Citocinina
|
|
1
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2X
|
1X
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2
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2X
|
1X
|
|
3
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1X
|
1X
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4
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1X
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1X
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5
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1X
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2X
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6
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1X
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2X
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7
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0.5X
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1X
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8
|
0.5X
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1X
|
|
9
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MS/2
|
|
Cultivo de callos
a 4 semanas de inicial el cultivo.
En esta
imagen se observa de forma más clara la formación de callo en el explane de
zanahoria después de 4 semanas que es la edad promedio de crecimiento
(teóricamente el cultivo de callos se deja en crecimiento para ver resultados
de 3 a 4 semanas).
ANALISIS Y DISCUSION DE
RESULTADOS
El cultivo se realizó a partir del cambium de
zanahoria
Las
células del cambium presentan las
características citológicas típicas de las células meristemáticas, pero además
son las únicas que pueden contener cloroplastos funcionales. Se originan a
partir de la desdiferenciación de células parenquimáticas o de las
colenquimáticas. Son células alargadas que se disponen en la corteza del tallo
formando un cilindro continuo o a distintos niveles de profundidad desde la
superficie formando placas.
Debido a estas características el crecimiento de
callo se facilita ya que se podía obtener regeneración de plantas a partir de cultivos de tejidos
Los resultados
obtenidos (generación de callo) dependen directamente de la concentración de los reguladores de
crecimiento
Se entiende por hormonas vegetales
aquellas substancias que son sintetizadas en un determinado lugar de la planta
y se translocan a otro, donde actúan a muy bajas concentraciones, regulando el
crecimiento, desarrollo ó metabolismo del vegetal. El término "substancias reguladoras
delcrecimiento" es más general y abarca a las substancias tanto de
orígenes naturales como sintetizados en laboratorio que determinan respuestas a
nivel de crecimiento, metabolismo ó desarrollo en la planta.
Las fitohormonas son las moléculas
responsables del desarrollo, aunque no se sabe bien cómo actúan en las células.
Se sabe que su mecanismo de acción es por interacción con un receptor
específico (la sensibilidad de un tejido hace referencia a su número de
receptores), y que su modo de acción una vez recibida la señal es por
transducción.
De la transducción se sabe poco, pero
parece ser que no es muy diferente de la de los animales.
Las rutas de transducción traducen la
señal en una respuesta.
La actuación depende de la sensibilidad
del tejido y de la concentración de la hormona. Se denomina nivel activo de una hormona a las
formas que desencadenan respuestas. Es necesario un control o homeostasis
hormonal, importante para el control del crecimiento, defensa ante situaciones
eventuales como cerrar constantemente los estomas en sequía.
AUXINAS
Son las primeras hormonas que se
describieron. Su estructura es un derivado del fenol o el indol, y tienen
anillos aromáticos con dobles enlaces conjugados. Todas son ácidos. Se
descubrieron a partir del efecto de curvatura de los tallos al cortar su parte
apical. No se sabe el modo de acción pero está relacionado directamente con su
estructura, ya que si se modifica pierde su función. Las auxinas principales son:
-Ácido indolacético: es con la que más se
ha experimentado.
-Ácido 4-cloroindolacético
-Ácido indolbutílico: actúa en el
enraizamiento.
-Ácido fenilacético
Efectos
Los efectos de las auxinas son:
Crecimiento: estimulan la
elongación celular en tallos y coleoptilos (tallos jóvenes), incrementan la
extensibilidad de la pared celular y estimulan la diferenciación del xilema y
el floema.
Tropismos: responsables del
fototropismo y gravotropismo.
Dominancia
apical: la yema
apical del tallo (produce la mayoría de auxinas) inhibe el crecimiento de yemas
axilares cercanas.
Abscisión de órganos (hojas,
flores y frutos): posee un control genético, y las auxinas retrasan la caída,
aunque el etileno la induce.
Rizogénesis: estimulan la
formación de raíces laterales o adventicias. Inhiben la elongación de la raíz
principal.
CITOCININAS
Son un grupo más reducido de hormonas que
deben su nombre a su función (citoquinesis). En conjunto con las auxinas estimulan la división celular. Derivan
de adeninas, y las más frecuentes son la quinetina y benciladenina (sintéticas)
y la zeatina (natural). La zeatina posee un doble enlace en el centro de la
cadena y tiene isómeros cis y trans que parecen ser formas naturales. La
zeatina puede estar en la base siguiente al 3’ del anticodón del ARNt.
Efectos
Los efectos que producen son:
Crecimiento: en conjunto con
las auxinas estimulan la proliferación de células meristemáticas, y también
estimulan la expansión de los cotiledones tras el primer haz de luz que
reciben.
Dominancia
apical: estimulan
el crecimiento de yemas laterales inhibiendo la apical (contrario a las
auxinas, por lo que deben estar en equilibrio).
Diferenciación
y morfogénesis: provocan cambios en la morfología según el tipo de crecimiento.
Junto a las auxinas estimulan la
formación de raíces y tallos.
Senescencia: son
anti-senescentes.
Las
respuestas que se producen tras la aplicación de auxinas a las plantas dependen
de la [hormona] así como del tipo de órgano tratado.
La [auxina] necesaria para estimular el crecimiento es menor en raíces
que en brotes laterales, y ésta es menor que en brotes apicales.
Por lo tanto las concentraciones que se utilizaron deben de estar
balanceadas para que el crecimiento sea óptimo por eso en los equipos 6 y 7 se
observó un buen crecimiento. Pero no solo estos factores son relevantes si no
que la buena esterilización el realizar el cultivo en condiciones óptimas
cuenta mucho.
Si se contamina el cultivo el crecimiento será bueno pero no de lo que
requerimos.
En general, el callo toma de 3 a 8
semanas para alcanzar el tamaño suficiente para efectuar un sub cultivo, como
fue en este caso el cultivo en suspensión antes de que el cultivo de callo estuviera en su ultima
fase que es la de envejecimiento y perdida de crecimiento acelerado, para
mantener la viabilidad de las células vegetales, es importante transferir
tejido visiblemente sano (sin contaminación por hongos ni bacterias, sin
necrosis).
No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el
material vegetal; tan sólo se hace 8-10 veces.
Ocurre entonces lo siguiente:
- El medio nutritivo se agota y se seca.
- El material vegetal ocupa todo el tubo.
- Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias tóxicas).
- El medio se hace líquido.
- El material vegetal ocupa todo el tubo.
- Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias tóxicas).
- El medio se hace líquido.
Aunque de forma natural los vegetales tienen
un potencial endógeno para la formación de callo, pues su medio natural, al
sufrir una lesión en un órgano, esta es reparada por este tejido. De especie a
especie se presenta una variación en esta capacidad, misma que se refleja en la
respuesta in vitro a la inducción de callo, encontrándose así tejidos para los
que el aducirse callo es requisito el
suplemento de una auxina o un regulador de crecimiento relacionado; otros requieren
solo una citocinina o un suplemento, tanto de auxina como de citocinina, o bien
solo responden en presencia de extractos de complejos naturales en el medio.
•
a)Inducción:En esta etapa las células del inoculo
inicial comienzan su crecimiento, tanto en numero como en tamaño.
Esta parte la observamos en la primera semana
•
b)
Proliferación celular:Durante
esta fase el tejido calloso aumenta su masa celular al máximo.
Esta s se dio entre la segunda a la cuarta semana del
•
c)
Inducción de la diferenciación: En
esta fase se obtienen meristemos tanto apicales como radiculares, embrioides,
tejido vascular, a partir de la masa celular del callo.
•
d)Envejecimiento y pérdida
de la capacidad de crecimiento acelerado.
Las
razones que dé a pesar que nuestro cultivo de callos fue optimo y nuestro
cultivo de callo en suspension no resulto a pesar de que se utilizó las
concentraciones de auxinas y citocininas que fueron las de mejor crecimiento
provado experimentalmente, son varias.
Desde
simples condiciones de no tener el ambiente adecuado de cultivo y que se
contamino nuestro cultivo hasta como de que las células de callo ya no eran
viables debido a su edad para el subcultivo.
Tampoco
las células se pudieron disgregar y simplemente se quedaron como cumulo de
células; debido a que el callo no era friable
CONCLUSIONES
Al
comparar nuestros resultados con los de los demás equipos (obtención de una
mejor calidad de callos) principalmente con los equipo 5 y 6 atribuimos los resultados a la concentración
de reguladores hormonales presentes en el medio de cultivo, también contribuyen
a un buen resultado el manejo adecuado de la técnica y materiales así como la
edad de la zanahoria aunque estos factores no definen el resultado obtenido, y
como el cultivo de callos es la base del cultivo en suspensión al no tener una
buena calidad de callos refiriendo me a buena calidad que fueran esponjoso y en
abundancia esto se reflejo en el cultivo en suspensión ya que aunque tuvimos
una proporción adecuada de callo este era muy compacto lo que no permitió que
se disgregar en el medio liquido y observáramos cúmulos de células después de 2
semanas de incubación con agitación.
Para que el callo pudiera crecer en condiciones idóneas era necesario tener un
ambiente estéril para no tener competencia en el crecimiento de las células
vegetales con otros microorganismos por los nutrientes. Muchos equipos no obtuvieron callos sin contaminación y más
aún, muchos ni siquiera obtuvieron callo porque desde un principio no
trabajaron en las condiciones adecuadas.
Son muchos los efectos que intervienen en la buena obtención de un callo. Para
empezar, se debe trabajar con un explante joven que tenga las células más
totipotenciales o que tiendan con mayor facilidad a la totipotencialidad. Se
debe trabajar en las condiciones adecuadas de esterilidad, asimismo, se debe
cuidar el tiempo de desinfección de la zanahoria pues un tiempo mayor haría que
penetrara el desinfectante al interior pudiendo dañar más células de las
necesarias. Por último, es importante agregar las cantidades adecuadas de
reguladores de crecimiento, tener un balance entre auxinas y citocinas pues
ello determinará en gran medida que se dé o no la producción de callo.
Un
balance correcto de citocinas y auxinas nos dará lugar a la producción de un
buen callo. Un buen callo es aquél que tiene las características de
esponjosidad, friabilidad, tamaño y textura adecuada. Para poder obtener un
cultivo en suspensión de un callo es necesario que sea lo más friable posible
para conseguir una adecuada disgregación celular. No se logró disgregar muy
bien a las células en el matraz pero se pudo al menos ver la presencia de las mismas
en agregados pequeños de células.
BIBLIOGRAFIA
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A. (2005). Avances recientes en
biotecnología vegetal e ingeniería genética en plantas (1ª ed.). España:
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importante función del boro en la producción. Chile.
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(2009). Brock. Biología de los
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Pearson Educación, pp. 343-350
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-http://cmapspublic2.ihmc.us/rid=1HVZJSFF5-108L2H5-NFR/Reg.%20del%20Crecimiento.pdf
- http://articulos.infojardin.com/Frutales/cultivo-in-vitro-reproduccion.htm
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